一、病因

　　PNH是一种获得性疾病，从来没有先天发病的报道(先天性CD59缺乏除外)，也没有家族聚集倾向。致使造血干细胞发生病变的确切原因尚不清楚。本病是一种获得性多能造血干细胞疾病，致病因素可能有化学、放射线或病毒感染等，致病染色体突变，发生异常干细胞株，其增殖、分化生成的红细胞、粒细胞和血小板都有共同缺陷。

　　PNH是造血干细胞基因突变引起的克罗恩病，病态细胞与正常细胞同时存在，病态血细胞都来自同一克隆，证据是：①在G6PD同工酶呈杂合子的女性PNH患者中，不正常的红细胞都具有同一种同工酶，说明异常细胞都出自同一来源;②近年来用分子生物学方法分析女性患者X染色体灭活类型，也可发现异常细胞都属同一类型;③用流式细胞仪可以看到PNH患者的外周血和骨髓中总是异常与正常细胞同时存在，而异常细胞都具有同样的不正常(如细胞表面缺乏CD59)，而患者的正常血细胞则无此种异常，说明有两种细胞来源;④PNH患者的异常细胞可以查到磷脂酰肌醇糖苷-A(PIG-A)基因突变，而同一患者的正常细胞则无此突变，进一步说明两者来源不同;⑤少数从PNH转变为急性白血病的白血病细胞可具有PNH膜蛋白缺失的特征，说明白血病来自原有的PNH克隆。鉴于同一PNH患者的异常细胞缺失膜蛋白的程度可有不同，还有一些患者的PIG-A基因突变类型可不只1种，因此推测有的PNH可能有1个以上异常克隆。PNH患者的红细胞、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、血小板等皆有膜蛋白缺失，可以想象基因突变必然发生在很早期的造血干细胞。但是为何PNH患者发生基因突变，有何外来的致突变原(mutagen)，尚不明了。此外，鉴于PNH患者常有1个以上的异常克隆，即有一种以上的PIG-A基因突变;另外，2002年Horikawa K等还报道：1个与PNH发病无关的次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖基酶(Hypoxanthine-Guanine phosphoribosyl transferase，HPRT)基因，在PNH患者中也易发生突变，换言之，PNH患者有PIG-A突变同时有HPRT突变者明显比没有PIG-A突变的正常人为多。因而提示：除外界的致突变原外，是否患者还有内在的基因不稳定性(gene instability)。但Purow DB等1999年也曾对PNH患者的2个无关基因即HPRT及TcR基因进行观察，结果表明：个别PNH患者同时具有上述2个基因之一的突变，而多数患者这2个基因没有改变。因而PNH患者是否具有普遍的基因不稳定性尚待进一步证实。

　　PNH患者的异常克隆不具有自主的无限扩增的本质，但毕竟要有一定的扩增能力，才能使异常细胞增多到足以产生疾病表现。鉴于PNH常与再生障碍性贫血(AA)相互转化或同时存在，因而想到两者是否在病因上也有关联，即PNH克隆只有在正常造血细胞受抑制时才得以扩张。这样，就要在致突变原之外，还要想到能引起AA的诸多病因，如由于某种因素如病毒、药物等所致的能抑制造血细胞的自身免疫性疾病等。这就是PNH的双重病因或两步发病的观点。

　　二、发病机制

　　PNH的发病机制涉及不只一个因素。

　　1.基因突变引起异常细胞克隆的出现

 PNH异常血细胞的共同特点是细胞膜表面缺乏一组膜蛋白，这种膜蛋白都通过糖肌醇磷脂(GPI)连接在膜上，统称糖肌醇磷脂连接蛋白(GPI连接蛋白)。所涉蛋白和GPI都在内质网形成，一蛋白生成后旋即与GPI连接，然后转移细胞膜外层。由于PNH细胞可以查到游离的这种蛋白和相应的mRNA，因此，可以推想PNH异常细胞缺少GPI连接蛋白不是由于不能生成蛋白而是因为不能生成GPI，所以这种蛋白就不能存在于膜上。GPI由脂质部分和核心结构组成，不同种类GPI的脂质部分差异很大，但核心结构却非常保守，均由1个肌醇磷脂、1个葡糖胺、3个甘露糖和1个乙醇胺按顺序相连构成，一头经肌醇磷脂上的2个脂肪酸(有的是3个)插入细胞膜脂质双层的外层，另一头由乙醇胺与蛋白相接。GPI生成的每一步都需1个关键酶。

　　近年，用病毒感染PNH的异常淋巴细胞(如用EB病毒感染B淋巴细胞)建立细胞株。与小鼠的已知缺乏GPI并且已明确GPI生成障碍发生在那一步的不同胸腺瘤细胞株[Thy-1(-)细胞株]进行融合。若融合后可以表达GPI连接蛋白，说明两者的缺陷不同，可以互补;若融合后仍不能表达GPI连接蛋白，说明两者的缺陷相同，所以不能互补。用这种细胞融合的方法已经在40例患者中得以证明PNH异常细胞的缺陷全都与A型Thy-1(-)细胞相同。缺乏GPI是由于生成GPI的第一步有障碍，即N-乙酰葡糖胺不能加到磷酸肌醇(PI)上去，因而不能进而再加入3个甘露糖和1个乙醇胺最后形成完整的GPI去连接蛋白。用放射性核素标记GPI的不同组分，观察GPI的生成过程，同样可以发现PNH异常细胞不能生成GPI是由于上述障碍。现知PNH异常细胞缺少1种蛋白，与小鼠的乙酰葡糖胺转移酶有很大的同源性。目前，这种蛋白的cDNA和基因核苷酸序列已经弄清，称PIG-A基因。用荧光原位杂交证明位于X染色体p22.1部位。研究表明，在所有已检测的PNH患者血细胞中都发现有PIG-A基因突变而导致GPI连接蛋白的部分或全部缺失，说明PIG-A基因突变在PNH发病中有重要作用。

　　PIG-A的cDNA有1452bp，编码484个氨基酸。PIG-A基因核苷酸序列全长17kbp以上，有6个外显子：第1个外显子只有23bp，编码5′端不翻译区;第2个外显子有777bp，编码5′端不翻译区的其他部分和大约半个蛋白;第3个外显子有133bp，编码一部分蛋白;第4个外显子133bp，编码一部分蛋白;第5个外显子207bp，编码一部分蛋白;第6个外显子长2316bp，编码蛋白的其余部分和3′端不翻译区。PIG-A基因的5′侧翼583bp区内有启动子活性。此区无TATA样序列，有4个CAAT框、2个AP-2序列、-1个CRE序列。PIG.A基因有2个可变剪接产物，分别少347和658个核苷酸。所以正常的PIG-A mRNA的RT-PCR产物也有3个条带，分别为1500bp、1250bp、850bp，后两者的编码产物皆无功能。

　　PNH的PIG-A基因突变为异质性，迄今已报道100余种基因突变，广泛分布于多个编码区及剪接点，没有突变丛集区或热点。而且，主要以小突变为主，大的突变罕见。有典型溶血症状的PNH与AA-PNH综合征相比，PIG-A突变的基因图谱无明显不同。据Rosse等(1995)综合11个实验室已报道的72例患者所见的84个突变中，53个为核苷酸缺失或插入，其中42个为缺失;大约1/3(84个突变中的24个)只有1个核苷酸缺失，仅有2个突变有大段(超过100个核苷酸)缺失;核苷酸插入相对较少，5例同时有缺失和插入。缺失或插入的主要后果是移码，在51个小缺失或(和)插入突变中45个导致过早出现终止码，使蛋白减小，1个越过终止码使蛋白增加32个氨基酸。还有4个缺失突变改变了外显子/内含子剪接部位，影响PIG-A mRNA的大小和稳定性。另有1个框内缺失，由于缺少3个核苷酸使蛋白缺少了第151个氨基酸(苯丙氨酸)。所有突变中1/3(84个突变中的31个)属点突变，1个核苷酸被另1个核苷酸替换。在这31个点突变中：18个为错义突变，使蛋白的氨基酸序列中1个氨基酸被另1个氨基酸代替;6个为无义突变，产生1个立即终止码;7个为剪接点突变，影响PIG-A mRNA大小和稳定性。至今没有发现过PIG-A基因5′启动子区或3′非翻译区的点突变。有1例大段缺失累及启动子区、第1个外显子和部分第1个内含子。Kinoshita等(1995)从汇集的62例得到同样认识，所有PNH患者均有PIG-A基因突变，突变部位随机分布，62例中56个突变只涉及1、2个碱基变化，突变的后果以移码最多见(占63%)。不同患者的PIG-A基因突变类型不同，在62例中只有5种突变同见于2、3个患者。若同一患者有2种异常细胞(GPI连接蛋白全无或缺少)，则可能源于2种突变产生的2种异常克隆，但事实上一些患者虽有2种异常细胞却只能查到1种突变，也有的患者只有1种GPI连接蛋白完全缺失的异常细胞，却能查出2种突变，这些病例都需仔细检查。Luzzatto于2000年分析了全球28篇报道的146例PNH患者的全部174个PIG-A突变，其中135个(包括大段将是PIG-A基因产物的完全失去活性，另一组中35个是错义突变、4个是小的框内缺失，其结果是PIG-A基因产物部分功能缺失。前一组形成的细胞完全缺失GPI连接蛋白(相当于PNH Ⅲ型细胞)，后一组形成的细胞部分缺失GPI连接蛋白(相当于PNHⅡ型细胞)。Norris等初步研究了PIG-A基因突变位点的不同对PIG-A蛋白结构和功能的影响。作者分析了18例PIG-A基因的错义突变，发现有6例位于编码子128～129和15l～156上，这些编码子位于小鼠和酵母PIG-A同源基因的高度保守的区域内，因此，猜想这些编码子可能编码PIG-A蛋白的关键部分。作者用点诱变的方法，获得具有这些编码子突变的PIG-A的cDNA，分别转入原核及真核表达系统，测其PIG-A蛋白的结构及功能。结果表明，编码组氨酸128(H128)、丝氨酸129(S129)和丝氨酸155(S155)的编码子发生错义突变可导致PIG-A蛋白功能的部分丧失，而发生于编码侧链氨基酸残基的编码子的错义突变对PIG-A蛋白功能无影响。提示编码H128、S129和S155的编码子是影响PIG-A蛋白功能的关键部分。

　　总而言之，PNH患者的PIG-A突变部位遍布第2～6外显子整个编码区的多个位置，以及一些内含子之中，没有突变热点。第2外显子较长，突变发生部位也较多。突变类型多种多样。不同患者的PIG-A突变常常不一样，目前只发现极个别的同样突变见于不同的患者。但是不知不同国家的患者是否可有差别，据报道，在日本20例突变中9个为碱基取代，只有1个为多碱基缺失;而在泰国的14例中只2个为碱基取代，却有4个为多碱基缺失;欧美国家中大片段缺失较日本多见些。不知各地的致突变原是否会有不同。

　　将正常的PIG-A cDNA转入PNH异常细胞可纠正后者不表达GPI连接蛋白的缺陷，PNH可由于PIG-A基因突变所致已能确定。然而，涉及GPI生成全过程的基因至少有12个，涉及上述第一步的基因除PIG-A外尚有PIG-C、PIG-H等。但除PIG-A外，其他基因都位于常染色体上，2个等位基因同时发生灭活突变的几率极小。而PIG-A基因位于X染色体上，即使在女性只要产生突变的X染色体未被随机灭活即可发病，所以至今除PIG-A基因突变外没有发现过其它基因突变引起的PNH。

　　2.异常细胞克隆的维持和扩增

 异常细胞克隆生成之后何以保持并能继续扩增，特别是在正常造血细胞同时存在下。异常细胞如何竞争，在数量上增长到足以引起疾病表现的程度，目前尚不清楚，能想到的有以下2个方面：

　　(1)异常细胞不易凋亡，生命力较强：

1997年Brodsky RA等和Horikawa K等分别报道PNH患者的异常血细胞有抵御凋亡的能力，从而用以解释异常细胞所占比例的增长。但是次年Ware RE等(1998)报道：有GPI连接蛋白的中性粒细胞与缺乏GPI连接蛋白的中性粒细胞凋亡率没有区别;将PIG-A的cDNA导入PNH表型的B-淋巴细胞株，导入前与导入后细胞对Fas配基或X线诱导的凋亡没有差别，说明PIG-A基因缺失与否不影响细胞凋亡。鉴于这种不同的观察结果，PNH异常细胞是否不易凋亡尚待进一步研究，今后应着重观察较早期的造血细胞，比较PNH患者自己的异常和正常的以及正常人的同类细胞，在生理条件下或可能发生于体内状况下的细胞凋亡。

　　(2)异常细胞具有更强的增殖能力：

给经过亚致死量照射的严重联合免疫缺损症小鼠输注PNH患者或正常人的骨髓，7个月后，正常人骨髓消失，PNH患者骨髓仍存在。我院韩冰等2000年用流式细胞分选出PNH患者的CD34 CD59 细胞与患者本人的CD34  CD59- 细胞及正常人的CD34  CD59 细胞比较，结果不论是单个细胞培养还是群体细胞培养，在液体培养基中均显示：PNH患者的CD34 CD59- 细胞的分裂、集落形成和扩增总数等均比本身的CD34  CD59 细胞为多，而两者又都比正常人的CD34  细胞为差。提示：PNH患者的早期造血细胞中表型异常者比表型正常者的增殖能力强，而两者都不如正常人的相应细胞，换言之，PNH的异常细胞对自身的正常细胞而言有一定的增殖优势，而患者的所谓正常细胞在增殖能力方面实际上不正常。但是，我院肖娟等同期用免疫磁株法分选细胞，在液体培养和半固体培养中都未能显示PNH异常表型细胞的增殖优势，然而，患者的正常表型与异常表型的早期造血细胞的增殖能力都远比正常人的同类细胞差，再次得到证实。另据报道，给PNH患者进行同基因骨髓移植，假如没经过适当预处理，病情一度缓解后，仍将复发，似乎又说明PNH克隆具有增殖优势。然而，认为PIG-A基因失活的造血细胞不具备内在的增殖优势的学者也可举出一些例证：譬如，PIG-A基因失活的胚胎干细胞不能存活生长，若在早期胚胎发育期灭活PIG-A基因，成功地造成嵌合体，开始造血时只有5%的红细胞和中性粒细胞缺乏GPI连接蛋白，其后百分数逐渐减少，最后稳定，说明这种细胞没有继续增殖的趋势;又如，Araten DJ等(1999)发现多数正常人血中有缺少CD55及CD59的红细胞和中性粒细胞，数量分别为22/100万和8/100万，并且也可查出PIG-A基因突变，但不发展为病。总之，PNH异常克隆是否具有内在的生长优势尚无定论，但是总体说来PNH患者的造血细胞增殖能力(不论是正常细胞还是异常细胞)都低于正常，可以确定。

　　(3)PNH异常克隆是在骨髓正常造血功能衰减的基础上才取得相对的生长优势：

我院李强等(1997)、肖娟等(2000)、韩冰等(2000)分别在自己的工作中发现同一现象，即PNH患者骨髓中的CD34  造血干/祖细胞比正常人少，而且其中CD59- 细胞又比CD59  明显为多，提示PNH患者的正常造血干/祖细胞数量少，异常造血干/祖细胞在数量上占有相对优势，可以推测PNH异常克隆是在正常造血功能衰竭的基础上才得以扩张的。2001年泰国Pakdeesuwan K等也有类似观察发现。早在1961年Dacie和Lewis等即提出在临床上PNH与再生障碍性贫血有密切关系，以后，许多学者证实并认为两者在发病机制上也有关联。近年的一种观点是PIG-A基因突变在正常人和不少情况下都可发生，但只有当正常造血功能衰竭时，才有可能发展为疾病。甚至认为必然有再障才会发生PNH，并且将注意力集中在自身免疫性再障上，提出正常造血细胞表面具有一些GPI连接蛋白，可以成为能刺激细胞杀伤性细胞(如T淋巴细胞)的抗原或协同刺激因子，从而被杀伤，而有PIG-A基因突变的细胞由于缺失GPI连接蛋白，因而可以逃避捕杀。Karadimitris A等(2000，2001)提出：分析T细胞的所有组成成分可能发现异常，自身反应性T细胞的靶向中有GPI连接蛋白。我院王毓洲等2000～2001年的工作也发现：PNH患者外周血中T8细胞/T4细胞比例增高，带有HLA-DR标志的活化的CD8。淋巴细胞增多;γ干扰素和IL-2对CD34  CD59  的正常造血干/祖细胞有抑制作用。支持PNH有免疫失常，并对正常造血细胞不利的说法。认为有免疫因素参与可以解释PNH发生于一些后天性再障之后，但很少发生在先天性再障或化疗药物引起的骨髓造血衰竭之后。然而，PNH与再障的关系可能没有这样简单，因为PNH的病症不发生在再障的骨髓抑制最严重的时期，而往往在再障恢复之后;另外，PNH常发生在再障患者应用免疫抑制剂。ATG等取得缓解以后，而不是在自身反应性T淋巴细胞未被抑制之时。再者，PNH患者病情的起伏和稳定乃至自然缓解，都需要另求解释。

　　(4)其他：

PNH患者的血清对正常造血干/祖细胞的影响，观察结果不一。据王毓洲2001年观察，患者的CD59  或淋巴细胞及其培养上清液对CD34  细胞的增殖均无影响;据韩冰2000年观察：PNH患者的骨髓成纤维细胞的集落形成能力正常，成纤维细胞的TNFα、IL-6的mRNA表达也正常;另有人观察，患者血清中EPO及G-CSF增高，IFNγ正常。另外Nishimura等提出：FGFβ受体也是GPI连接蛋白，PNH的造血细胞由于缺乏TGF受体，所以不受TGF的增殖抑制作用。

　　总之，关于PNH的发病机制近年虽有不少研究，PIG-A基因突变和骨髓正常造血细胞增殖功能衰减是两个重要因素，但是如何形成异常造血细胞与正常造血细胞生成和增殖的不均衡状态，异常细胞如何在数量上取得优势，影响异常细胞数量和PNH病情发展和变化的因素是什么，PNH如何得到自然缓解，造血微环境有无变化等，都还需要进一步研究。